Tế bào nội mô vi mạch của võng mạc người

Tất cả các sản phẩm của công ty chỉ dành cho thí nghiệm khoa học, không sử dụng ngoài các thí nghiệm khoa học khác!

Nội mô vi mạch võng mạc của con người được phân lập từ mô võng mạc; Võng mạc nằm ở bên trong vách nhãn cầu, là một lớp màng mỏng trong suốt. Võng mạc bao gồm vỏ thượng bì sắc tố và lớp cảm giác võng mạc, giữa hai lớp có thể tách ra trong trường hợp bệnh lý, được gọi là tách võng mạc. Vỏ thượng bì sắc tố được liên kết chặt chẽ với màng mạch và bao gồm các tế bào biểu mô sắc tố có vai trò hỗ trợ và nuôi dưỡng các tế bào thụ cảm ánh sáng, che ánh sáng, tản nhiệt, tái tạo và sửa chữa. Về mặt mô học võng mạc được chia thành10 lớp, từ ngoài vào trong lần lượt là: lớp vỏ trên sắc tố, hình nón, lớp tế bào que, màng ngoài, lớp hạt ngoài, lớp bụi ngoài, lớp hạt trong, lớp bụi trong, lớp tế bào hạch thần kinh, lớp sợi thần kinh, lớp màng trong. Lớp bên trong võng mạc là một lớp màng mỏng tôn lên lớp bên trong màng mạch máu, có tác dụng cảm quang; Có núm vú thần kinh thị giác ở phía sau mũi. Lớp giác quan trên võng mạc được tạo thành từ ba tế bào thần kinh. Tế bào thần kinh là lớp tế bào thị giác, chuyên về cảm quang, nó bao gồm tế bào hình nón và tế bào que. Các tế bào que chủ yếu ở võng mạc cách xa hốc trung tâm, trong khi các tế bào hình nón có nhiều nhất ở hốc trung tâm. Lớp thứ hai được gọi là tế bào nhị phân, có khoảng 10 đến hàng trăm tế bào thị giác liên kết với một tế bào hạch thông qua các tế bào nhị phân và chịu trách nhiệm liên lạc. Tầng thứ ba gọi là tầng tế bào tiết, chuyên quản truyền dẫn. Võng mạc là một lớp mỏng nhưng rất phức tạp của cấu trúc được gắn vào thành sau của nhãn cầu, nơi các sợi thần kinh truyền xung từ thụ thể võng mạc đi qua bề mặt võng mạc và đi qua dây thần kinh thị giác đến lối ra. Độ phân giải của võng mạc là không đồng đều, ở vùng hoàng điểm, khả năng phân biệt của nó rất mạnh. Nó là một lớp duy nhất của các tế bào biểu mô phẳng tạo nên bề mặt khoang mạch máu. Các hoạt chất sinh học được sản xuất và tiết ra có vai trò quan trọng trong việc duy trì sức căng mạch máu, điều chỉnh huyết áp, chống đông máu, v.v. và có ý nghĩa sinh lý bệnh lý quan trọng trong cơ chế sinh bệnh của bệnh mạch máu võng mạc. Vì các tế bào nội mô thu được từ các mô và cơ quan khác nhau có các đặc tính khác nhau, trong não và võng mạc, các tế bào nội mô này có chức năng rào cản bên trong và đóng một vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh trạng thái sinh lý của mạch máu, giải phóng các hoạt chất mạch máu, cũng như sự hình thành các mạch máu mới, nuôi cấy tách ống nghiệm RCEC có ý nghĩa lâm sàng quan trọng trong việc nghiên cứu các cơ chế sinh lý bệnh lý trong đó các bệnh mạch máu võng mạc phát triển và điều trị sớm bệnh.
Giới thiệu phương pháp:

Phòng thí nghiệm của công ty cô lập nội mô vi mạch võng mạc của con người sử dụng collagen- Phương pháp tiêu hóa hỗn hợp Dan-White trung tính kết hợp với phương pháp ly tâm gradient mật độ, cuối cùng được chuẩn bị thông qua sàng lọc nuôi cấy đặc biệt cho tế bào nội mô, tổng lượng tế bào khoảng 5 × 10? Cells/chai
Kiểm tra chất lượng:

Vi mạch nội mô võng mạc của con người được phân lập trong phòng thí nghiệm của công tyCD31 miễn dịch huỳnh quang xác định, độ tinh khiết có thể đạt hơn 90% và không chứa HIV-1, HBV, HCV, mycoplasma, vi khuẩn, nấm men và nấm, v.v.

Điều kiện gói PLL（0.1mg/ml）， Gelatin (0,1%)

Môi trường hàmFBS、 Phụ gia tăng trưởng, Penicillin, Streptomycin, vv

Tần số thay đổi chất lỏng mỗi2-3 ngày thay đổi chất lỏng một lần

Đặc tính tăng trưởng Dán tường

Hình thái tế bào Giống tế bào nội mô

Đặc điểm truyền tải Có thể truyền2-3 thế hệ

Dịch tiêu hóa 0,25% của yi protease

Điều kiện nuôi dưỡng Pha khí: Không khí,95%； CO2, 5%

Chuẩn bị

1. Chuẩn bị thiết bị thí nghiệm: Chuẩn bị đĩa petri vô trùng, chai petri, pipet, ống ly tâm, dụng cụ phẫu thuật, v.v. và thực hiện khử trùng bằng nồi hấp hoặc các phương pháp khử trùng thích hợp khác.

2. Chuẩn bị thuốc thử: Xây dựng hoặc mua thuốc thử thích hợp cho môi trường, enzyme tiêu hóa (ví dụ, collagen, v.v.), huyết thanh bò thai, kháng kép, v.v., để đảm bảo nó vô trùng và trong ngày hết hạn.

3. Chuẩn bị động vật thí nghiệm hoặc nguồn mô: theo nhu cầu thí nghiệm, chọn động vật thích hợp và gây mê hoặc tử hình tương ứng, lấy mô mong muốn; Hoặc lấy mô từ một thư viện mẫu mô đã có.

Khai thác và xử lý

1. Lấy vật liệu: Trong điều kiện vô trùng, nhanh chóng loại bỏ mô mục tiêu, giảm thiểu thiệt hại cho mô và loại bỏ chất béo dư thừa, mô liên kết và các mô không mục đích khác.

2. Rửa sạch: Rửa sạch các mô lấy ra nhiều lần với PBS vô trùng được làm lạnh trước để loại bỏ máu và tạp chất.

Cắt: Cắt mô thành các miếng nhỏ khoảng 1-2mm³ để tiêu hóa tiếp theo.

Tách tế bào

1. Tiêu hóa: Đặt các khối mô bị cắt nhỏ vào ống ly tâm có chứa một lượng enzyme tiêu hóa vừa phải, tiêu hóa trong một thời gian trong máy lắc nhiệt độ không đổi 37 ℃ hoặc hộp nuôi cấy. Trong thời gian đó có thể nhẹ nhàng lay động ống ly tâm, làm cho tiêu hóa đều đặn hơn.

2. Chấm dứt tiêu hóa: Khi phần lớn các khối mô được tiêu hóa thành đình chỉ đơn bào hoặc các cụm tế bào nhỏ, việc bổ sung môi trường chứa huyết thanh chấm dứt tiêu hóa.

3. Lọc và ly tâm: Lọc đình chỉ tế bào bằng sàng tế bào, loại bỏ các mảnh mô không tiêu hóa, sau đó ly tâm bộ lọc với tốc độ quay thích hợp, thu thập lượng mưa tế bào.

Quan sát và phát hiện tế bào

1. Quan sát hàng ngày: quan sát hình thái, trạng thái tăng trưởng, mật độ của tế bào bằng kính hiển vi đảo ngược hàng ngày, ghi lại những thay đổi của tế bào, chẳng hạn như phát hiện ô nhiễm tế bào hoặc bất thường, thực hiện các biện pháp tương ứng kịp thời.
2. Số lượng tế bào và kiểm tra sức sống: Khi cần thiết, các phương pháp như nhuộm màu Taizhang và các phương pháp khác có thể được sử dụng để đếm và kiểm tra sức sống của tế bào để hiểu tình trạng tăng trưởng và sức khỏe của tế bào.

I. Lấy và tách

1. Hoạt động nhanh

- Cần xử lý ngay sau khi lấy mô, tránh tiếp xúc lâu với nhiệt độ phòng hoặc môi trường không dinh dưỡng.

- Rửa sạch mô bằng PBS vô trùng hoặc nước muối sinh lý để loại bỏ máu, tạp chất.

2. Lựa chọn enzyme tiêu hóa

- Chọn enzyme tiêu hóa theo loại mô, tránh tổn thương tế bào do tiêu hóa quá mức.

Thời gian tiêu hóa cần được kiểm soát chặt chẽ (thường là 10-30 phút) và trạng thái phân ly tế bào có thể được quan sát bằng kính hiển vi.

II. Tối ưu hóa điều kiện bồi dưỡng

1. Lựa chọn môi trường

- Sử dụng môi trường có chứa huyết thanh hoặc các yếu tố tăng trưởng cụ thể (ví dụ: DMEM, RPMI 1640, v.v.), một số tế bào cần thêm insulin, EGF, v.v.

- Tránh thường xuyên thay đổi thương hiệu môi trường hoặc lô, giảm áp lực thích nghi tế bào.

2. Dán tường và truyền lại

- Các tế bào thế hệ đầu có khả năng dán tường yếu và có thể cần bọc đĩa petri (ví dụ: collagen, polylysine).

- Mật độ thời gian truyền được khuyến nghị kiểm soát ở mức 70% -80%, hội tụ quá mức dẫn đến ức chế tiếp xúc và sự khác biệt.

III. Kiểm soát ô nhiễm

1. Hoạt động vô trùng

- Toàn bộ quá trình vận hành trên bàn siêu sạch, sử dụng vật tư tiêu hao một lần, tránh ô nhiễm chéo.

Kháng kép có thể được thêm vào môi trường nuôi cấy, nhưng sử dụng lâu dài có thể ảnh hưởng đến hoạt động của tế bào.

2. Xét nghiệm Mycoplasma

- Thường xuyên kiểm tra ô nhiễm Mycoplasma (ví dụ như phương pháp PCR), các tế bào cần được loại bỏ kịp thời sau khi bị ô nhiễm.

IV. Giám sát tình trạng

1. Quan sát hàng ngày

- Kiểm tra hình thái tế bào, mật độ và màu sắc môi trường hàng ngày, kịp thời thay thế môi trường (thường là 2-3 ngày một lần).

Các hình thái bất thường (chẳng hạn như các tế bào tròn, nhiều mảnh vỡ) có thể gợi ý ô nhiễm hoặc thiếu dinh dưỡng.

2. Truyền thừa và lưu trữ đông lạnh

Số lần phân chia tế bào nguyên thủy có hạn (bình thường 5 - 10 thế hệ), cần kịp thời đóng băng tế bào thế hệ đầu.

- Dung dịch đông lạnh được khuyến cáo sử dụng huyết thanh DMSO+(hoặc môi trường đông lạnh đặc biệt), bảo quản nitơ lỏng sau khi gradient làm mát.