Phân tích nhân bản và biểu hiện tế bào cảm nhận điện từ Agrobacterium

EHA105 (pSoup) tế bào điện năng

Agrobacterium điện chuyển tế bào cảm nhận

Nhãn sản phẩm:

Chủng EHA105; Tế bào trạng thái cảm nhận Agrobacterium; Rifampicin (Rif) rifu bình; (văn) ① Lầm lẫn; ② Giả dối. EHA101； LBA4404； GV3101； AGL1； Nghiên cứu thực vật biến đổi gen;

Đặt hàng sản phẩm:Bao bì lớn hơn hoặc vấn đề kỹ thuật sản phẩm,

Mô tả sản phẩm:

Chủng EHA105 được biến đổi từ chủng EHA101, nền nhiễm sắc thể là C58, gen hạt nhân chứa nhãn sàng lọc - rif gen kháng Rif, để tạo điều kiện cho hoạt động chuyển đổi, chủng này mang một loại succine Ti plasmid pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) không có chức năng vận chuyển riêng, plasmid này chứa gen vir (vir gen là yếu tố cần thiết để T-DNA chèn vào bộ gen thực vật, pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) plasmid của chính nó chức năng chuyển T-DNA mặc dù bị phá hủy, nhưng có thể giúp chuyển sang vận chuyển song nguyên T-DNA trơn tru. Chuyển sang chủng EHA105 plasmid trợ giúp: pSoup, tức là thu được: chủng EHA105 (pSoup), giúp tái tạo dòng plasmid pGreen, 62SK, pGs2 trong vi khuẩn Agrobacterium, đồng thời cho chủng này kháng tetracycline (tetR), thích hợp cho các hoạt động biến đổi gen của cây trồng như lúa, thuốc lá.

Các tế bào cảm thụ điện EHA105 (pSoup) do công ty chúng tôi cung cấp được sản xuất theo một quy trình đặc biệt, đặc biệt thích hợp cho việc chuyển đổi các plasmid lớn. Kiểu gen C58 (rifR) Ti pEHA105 (pSoup) (pTiBo542DT-DNA) Succinamopine (pSoup-tetR), có hiệu suất chuyển đổi>105cfu/μg DNA bằng xét nghiệm plasmid pGs2.

Thành phần sản phẩm:

Điều kiện bảo quản&vận chuyển:

Bảo quản: -80 ℃ Bảo quản, có hiệu lực trong 1 năm.

Vận chuyển: Vận chuyển đá khô.

Lưu ý

1) Các tế bào trạng thái cảm nhận nên được bảo quản ở -80 ° C, không được đông lạnh và đặt quá lâu, để tránh làm giảm hiệu quả chuyển đổi của các tế bào trạng thái cảm nhận.

2) Toàn bộ hoạt động chuyển đổi được thực hiện theo yêu cầu nhiệt độ và điều kiện vô trùng tương ứng.

3) Thể tích của plasmid được thêm vào không được lớn hơn 1/10 thể tích trạng thái cảm nhận. Sự không tinh khiết của plasmid hoặc sự hiện diện của ô nhiễm với các chất hữu cơ như ethanol có thể dẫn đến giảm mạnh hiệu quả chuyển đổi. Các plasmid tăng gấp đôi và hiệu suất chuyển đổi giảm một bậc độ lớn.

4) Để đảm bảo zui hiệu quả chuyển đổi cao, toàn bộ quá trình vận hành nên cố gắng nhẹ nhàng và giữ nhiệt độ thấp.

5) Chuyển đổi nồng độ plasmid cao có thể làm giảm lượng sử dụng tấm phủ cuối cùng tương ứng.

6) Khi mật độ nhân bản trên tấm quá lớn, nhân bản phát triển chậm và các thuộc địa trở nên nhỏ hơn do thiếu dinh dưỡng. Để có được các thuộc địa lớn, cần giảm lượng plasmid.

7) Mục đích của việc thêm rifupin vào môi trường nuôi cấy là ngăn chặn sự phát triển của các tạp khuẩn, sàng lọc vi khuẩn Agrobacterium; Theo các chủng được sử dụng kháng thêm Chainmei hoặc Qingdamei có thể ngăn chặn sự mất mát của Ti plasmid, nhưng Chainmei không có lợi cho hoạt động biến đổi gen của Agrobacterium, nói chung nuôi cấy Agrobacterium không xem xét Chainmei hoặc Qingdamei, vì xác suất mất Ti plasmid là rất thấp (về cơ bản có thể bỏ qua)

8) Vì sự an toàn và sức khỏe của bạn, vui lòng mặc quần áo thử nghiệm và vận hành bằng găng tay dùng một lần.

Cách sử dụng

1) Lấy cốc sốc điện 0,1 cm và nắp cốc ra khỏi dung dịch lưu trữ và đảo ngược 5 phút trên giấy hấp thụ sạch sẽ, để ráo nước, đặt 5 phút tích cực, làm cho ethanol bay hơi đầy đủ sạch sẽ, ngay lập tức chèn vào băng, nén bề mặt băng, đầu cốc điện cực 0,5 cm từ bề mặt băng để dễ dàng đóng nắp cốc, 5 phút để làm mát nó hoàn toàn.

2) Lấy các tế bào cảm thụ được bảo quản ở -80 ℃ và chèn vào băng trong 5 phút, cho đến khi nó tan chảy.

3) Thêm 0,01~1 μg (thể tích không lớn hơn 6 μl) plasmid DNA vào 50 μl đình chỉ tế bào trạng thái thụ thể, sử dụng bàn tay bo đánh đáy ống để trộn đều, ngay lập tức chèn vào băng. Dùng súng nhẹ nhàng thổi trộn đều tế bào cảm thụ - plasmid sau đó nhanh chóng chuyển vào cốc điện giật, đậy nắp cốc, ống rỗng vẫn còn chờ [Lưu ý: do hiệu quả chuyển đổi trạng thái cảm thụ cao hơn, di một lần sử dụng zuihao làm tiền thí nghiệm để xác định lượng plasmid của zuijia].

4) Khởi động bộ chuyển đổi điện, thiết lập các thông số: C=25μF, PC=200 ohm, V=2400 V (tham số này tham khảo Bio-rad, sử dụng cụ thể xin vui lòng tham khảo các bước đề nghị của bộ chuyển đổi điện để hoạt động), đặt cốc sốc điện nhanh chóng vào khe điện, sốc điện hoàn thành nhanh chóng chèn vào băng.

5) 700μl LB không có kháng sinh được thêm vào và chuyển vào ống rỗng cảm nhận, nuôi cấy 2~3h tại dao động 28 ℃.

6) 6,000rpm ly tâm 1 phút, để lại khoảng 100ul rõ ràng, sau đó nhẹ nhàng thổi vào cơ thể treo nặng bằng súng. Sau đó thêm vào một tấm LB hoặc YEB có chứa kháng sinh tương ứng và nhẹ nhàng sơn các tế bào đồng đều bằng một thanh vô trùng. 10 phút ở nhiệt độ phòng, sau khi chất lỏng được hấp thụ, lật ngược tấm phẳng, nuôi cấy ở 28 ℃ trong 2-3 ngày. [Lưu ý: Khi tấm chỉ chứa kháng sinh vận chuyển kép được sử dụng để chuyển đổi, 28oC nuôi cấy 48h là được; Khi thuốc kháng sinh vận chuyển kép được thêm vào máy tính bảng, cần thêm 10μg/ml rifu bình thường để nuôi 48-60h ở 28oC; khi thuốc kháng sinh vận chuyển kép được thêm vào máy tính bảng, cần thêm 20μg/ml rifu bình thường để nuôi 60-72h ở 28oC; không nên sử dụng hơn 20μg/ml rifu bình thường để nuôi cấy trên máy tính bảng hoặc chất lỏng.

7) Nuôi cấy chất lỏng nhân bản mục đích:

j Lượng nhỏ rung động: Thêm 1 ml dung dịch LB chứa kháng sinh tương ứng vào ống nghiệm thoáng khí đáy tròn 15ml, chọn 1-2 thuộc địa đơn lẻ từ tấm nuôi cấy tươi để tiêm chủng, 30 ℃, 200 vòng/phút rung động 24-48h.

k số lượng lớn rung động: 100ml thoáng khí tam giác chai thêm ít hơn 20ml LB chất lỏng môi trường với kháng sinh tương ứng, lấy nhỏ rung động chất lỏng theo tỷ lệ 2% tiếp xúc với nấm, 30 ℃, 200rpm rung động 24-48h.

[Lưu ý]: Đối với vi khuẩn Agrobacterium (vi khuẩn hiếu khí), cần rất nhiều oxy cho dù đó là một tấm phẳng rắn hay chất lỏng. Chìa khóa thành công của chất lỏng lắc là để đảm bảo rằng môi trường có đủ oxy hòa tan, có thể được kiểm soát bằng các phương pháp sau: j với ống nghiệm thoáng khí hoặc chai tam giác; k đảm bảo chất lỏng dinh dưỡng có mặt cắt ngang lớn và độ dày nhỏ; l Thuốc kháng sinh cố gắng thêm hoặc không thêm, thuốc kháng sinh phải thêm vào cố gắng sử dụng nồng độ thấp nhất có thể.

REFERENCES [Tên bảng tham chiếu] (

Lịch trình 1 Công thức môi trường LB rắn và lỏng

Lịch trình 2 Công thức môi trường YEB rắn và lỏng

Schedule 3 General Table of Common Agrobacterium Nhạy cảm với kháng sinh

- Written/Edited by V. Shallan (Bản quyền thuộc về MKBio)

Thượng Hải Mậu Khang Công nghệ sinh học Công ty TNHH là một đại lý, dụng cụ và phòng thí nghiệm hàng tiêu dùng và dịch vụ thí nghiệm tham gia nghiên cứu trong lĩnh vực khoa học đời sống và công nghệ sinh học, chủ yếu tham gia vào sinh học tế bào, thực vật học, sinh học phân tử, miễn dịch học, hóa sinh, protein học. Các lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất thuốc thử sinh học và chẩn đoán. Công ty chúng tôi tuân thủ triết lý kinh doanh "lấy con người làm gốc, lấy sự chân thành làm niềm tin và giữ chữ tín trong hợp đồng". Kiên trì nguyên tắc "bảo đảm chất lượng" cung cấp sản phẩm chất lượng cao cho đông đảo khách hàng.